檢測說明

環(huán)二鳥苷單磷酸 (c-di-GMP) 檢測是一種簡單的混合讀取、高選擇性、HTS 就緒檢測，用于測量細(xì)胞中的 c-di-GMP 水平。這種均相測定可用于檢測任何產(chǎn)生 c-di-GMP 的生化或酶促反應(yīng)中的 c-di-GMP，或用于監(jiān)測細(xì)胞內(nèi) c-di-GMP 濃度的細(xì)胞應(yīng)用。

測定原理

熒光信號的演變?nèi)Q于 c-di-GMP 與傳感器中 c-di-GMP 核糖開關(guān)的初始結(jié)合。這導(dǎo)致菠菜TM適體的穩(wěn)定，進(jìn)而結(jié)合 DFHBI-1T 以產(chǎn)生熒光。可以使用 GFP/FITC 濾光片組或 482nm 激發(fā)和 505nm 發(fā)射來測量熒光。

便于使用

c-di-GMP 檢測易于使用且均質(zhì)。只需將您的樣品與提供的檢測試劑一起孵育 30 分鐘，然后在帶有 FITC/GFP 濾光片或激發(fā)波長 482nm 和發(fā)射波長 505nm 的熒光讀板機(jī)上讀取樣品。

快速響應(yīng)和良好的信號穩(wěn)定性

c-di-GMP 傳感器在檢測 c-di-GMP 時會迅速產(chǎn)生信號，因此可以進(jìn)行快速測量。熒光信號隨著時間的推移是穩(wěn)定的，因此允許樣品的批處理模式。早在測定設(shè)置的 30 分鐘即可獲得出色的 HTS 參數(shù)，并在很長一段時間內(nèi)保持高水平。

寬動態(tài)范圍

該檢測即使在 50nM 的 c-di-GMP 下也很靈敏，并且具有寬廣的動態(tài)范圍。

選擇性

c-di-GMP 傳感器對 c-di-GMP 具有高度選擇性，不受常見反配體的干擾。

即使與過量 500 – 1,000 倍的反配體（例如 GMP、pGpG 和 c-AMP-GMP）相比，該測定也實現(xiàn)了出色的 HTS 測定參數(shù)（Z 因子 >0.9）。

與基于細(xì)胞的檢測的兼容性

c-di-GMP 測定可用于以均質(zhì)形式測量細(xì)菌中的細(xì)胞內(nèi) c-di-GMP 濃度，無需造粒、裂解或洗滌步驟。只需用 BC 試劑補充含有細(xì)菌培養(yǎng)物的測定緩沖液，添加傳感器和熒光團(tuán)，孵育 30 分鐘，然后在熒光閱讀器上讀取。

細(xì)菌中的 c-di-GMP 估計

表達(dá)野生型 WspR（來自銅綠 假單胞菌的二鳥苷酸環(huán)化酶）的大腸桿菌細(xì)胞用呋喃西林（抗生素）、二甲基甲酰胺/DMF（載體）處理或不處理（對照）。此外，還以不同的細(xì)胞密度接種細(xì)菌以模擬不同的 c-di-GMP 水平。在 96 孔板中生長的細(xì)菌細(xì)胞中的 Cyclic-di-GMP 濃度在沒有任何沉淀、洗滌、裂解或有機(jī)提取的情況下進(jìn)行測量。

c-di-GMP 標(biāo)準(zhǔn)曲線

抗生素或載體的存在不影響 c-di-GMP 測定的性能。

WT WspR 細(xì)胞中的 c-di-GMP 估計

c-di-GMP 測定顯示細(xì)菌中 c-di-GMP 濃度的變化，以響應(yīng)抗生素處理和不同細(xì)菌細(xì)胞密度。

該產(chǎn)品被引用于：

凝聚素通過控制表型程序對銅綠假單胞菌角膜毒力至關(guān)重要。趙和等。生物Rxiv。2021。